|
作者：劉毅
【摘要】 胚胎干細胞是一類具有自我更新和高度增殖能力的全能干細胞。自1998年人類胚胎干細胞在體外成功培養(yǎng)后，國內(nèi)外學(xué)者進行了大量的研究，越來越多的研究顯示將胚胎干細胞作為細胞供體進行角膜移植和視網(wǎng)膜移植，可能補充損傷細胞，重建眼表和恢復(fù)視網(wǎng)膜功能，給一些難治性眼表及視網(wǎng)膜疾病的治療提供了新的途徑。本文就胚胎干細胞移植在眼科的應(yīng)用前景作一綜述。
【關(guān)鍵詞】 胚胎干細胞 移植 細胞治療
0引言
1998年，當(dāng)Thomson等[1]第一次從胚胎中分離培養(yǎng)了人體胚胎干細胞，并隨后發(fā)現(xiàn)它能分化為體內(nèi)幾乎所有的細胞以后，干細胞成為人類在21世紀(jì)的偉大科技成果之一，人們對干細胞注入了極大的熱情。干細胞是一類具有自我更新、高度增殖及多向分化潛能的細胞，主要分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)是來源于人或動物胚胎內(nèi)的細胞團或原始生殖嵴的一種多能細胞,幾乎可以向所有的成年組織分化。多數(shù)致盲性眼病，如嚴(yán)重的眼表疾病、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性等，均存在著不可逆的細胞損傷和變性的病理過程，因此，應(yīng)用ESCs作為細胞供體進行移植治療，可能補充損傷細胞，重建眼表和恢復(fù)視網(wǎng)膜功能，為這類疾病的患者重見光明帶來了希望。本文將對ESCs在眼科的研究進展及應(yīng)用前景進行綜述。
1胚胎干細胞概述
1.1 ESCs的生物學(xué)特性 ESCs是從哺乳動物早期胚胎內(nèi)細胞團(inner cell mass ,ICM) 或原始生殖細胞(primary germ cell , PGC)經(jīng)體外分離,抑制分化培養(yǎng)獲得的一種二倍體細胞。這類細胞在適宜培養(yǎng)基中可無限增殖并保持未分化狀態(tài)，具有多向分化潛能，在體內(nèi)體外都可形成廣泛的細胞類型[2,3]。它具有以下特性: ①ESCs具有分化的多潛能性在體外可誘導(dǎo)分化出屬于3個胚層的分化細胞;②ESCs具有種系傳遞的功能;③ESCs具有長期的未分化增殖能力,細胞不僅能分化成各種器官組織而且能增殖生成新的保持同種性狀的ESCs;④ESCs易于進行基因改造操作;⑤ESCs保留了正常二倍體的性質(zhì)且核型正常。Thomson等建立的五株ESCs在體外經(jīng)過4～5mo未分化增殖，依然保持分化形成滋養(yǎng)層及所有三胚層組織的能力，將ESCs注射到SCID小鼠，小鼠可形成含有三胚層組織來源的畸胎瘤。大多數(shù)哺乳動物ESCs細胞均表達較高的堿性磷酸酶(AKP)活性,而且表達高端粒酶活性，即使培養(yǎng)1a，傳代300代仍具有高端粒酶活性[4]。未分化的人ESCs 除表達多潛能干細胞典型標(biāo)記物如OCT4、AKP等外，還表達階段特異性胚胎抗原3、4(SSEA-3，SSEA-4)，高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-80、TG30、TG343，而未分化的鼠ESCs不表達SSEA-3或SSEA-4，但特異性表達SSEA-1，說明人類和鼠的胚胎發(fā)育過程存在著基本種族差異[5]。盡管以上細胞標(biāo)記物沒有一個是完全的特異性ESCs 標(biāo)記物，但作為整體出現(xiàn)與ESCs未分化狀態(tài)卻有密切聯(lián)系[2]。ESCs在體外可以擴增，又能維持不分化狀態(tài)和發(fā)育全能性，可對它進行遺傳操作，因此，是進行細胞移植治療的良好種子細胞。然而，明確控制胚胎干細胞向特定細胞分化的基因和環(huán)境信號，以及胚胎干細胞移植的組織相容性仍是一個難題，還需大量的實驗和理論研究。
1.2 ESCs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 在小鼠的ESCs研究中人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩條各自獨立的干細胞分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF)通路和Oct4通路。它們在保持細胞多能性及支持其未分化狀態(tài)的生長有重要作用。研究表明,LIF通過與gp130-LIF 受體結(jié)合來激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3( signal transducer and activator of transcription 3)從而來支持ESCs的分裂增殖。但最近有人報道:活化STAT3 信號能維持鼠ESCs的多能性,但LIF/ STAT3 信號通路不能維持人ESCS的自我更新及多能性[6,7]。Oct4是一種POU-V相關(guān)的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,它與小鼠全能細胞的表型有關(guān)。進一步的研究證明,Oct4可阻止ICM向體細胞分化,是胚胎發(fā)展期保持細胞處于未分化狀態(tài)的關(guān)鍵因素。另有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Nanog在保持嚙齒類動物的ESCs處于未分化狀態(tài)中也起一定的作用。Nanog的表達比Oct4稍晚一些,對于保持ICM及ESCs的未分化狀態(tài)有重要意義。
2胚胎干細胞在眼科的研究現(xiàn)狀
2.1胚胎干細胞與角膜 嚴(yán)重的眼表疾病如Stevens-Johnson綜合癥、化學(xué)性燒傷等，可以引起角膜緣上皮細胞缺失，導(dǎo)致球結(jié)膜上皮化、角膜新生血管形成和結(jié)膜瘢痕，最終導(dǎo)致視力喪失。雖然目前自體角膜緣干細胞移植[8]和口唇粘膜[9]移植可以成功的進行眼表重建，但一些嚴(yán)重的眼表疾病如Stevens-Johnson綜合癥，通常是雙眼發(fā)生病變，且口唇粘膜同時受累，因此，將ESCs誘導(dǎo)形成角膜緣干細胞，為治療此類疾病提供了新的思路。王智崇等[10]用表層角膜緣基質(zhì)接觸誘導(dǎo)ESCs，在體外分化成為單一形態(tài)的較大細胞，裸鼠皮下移植后形成細胞復(fù)層，電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)細胞核呈扁平狀，細胞表面有微絨毛結(jié)構(gòu)，符合角膜緣干細胞的部分形態(tài)學(xué)特征，而體外培養(yǎng)條件下，角膜基質(zhì)剝離面的ESCs細胞仍保持其小細胞狀態(tài)不變，未經(jīng)表層角膜緣基質(zhì)誘導(dǎo)的ESCs細胞裸鼠皮下注射后分化為畸胎瘤樣結(jié)構(gòu)，表明表層角膜緣基質(zhì)的這種微妙的調(diào)節(jié)微環(huán)境具有誘導(dǎo)ESCs細胞定向分化為角膜緣干細胞的潛能。2001年，喻瓴等將大鼠ESC 細胞與兔角膜緣上皮細胞共同培養(yǎng)以誘導(dǎo)其分化,結(jié)果由ESCs分化出的細胞具有上皮細胞表型,并且還表達角膜上皮細胞特異性標(biāo)志物細胞角蛋白K3/ K12[11]。最近，Homma等[12]將小鼠ESCs用Ⅳ型膠原接觸誘導(dǎo)后形成上皮祖細胞，其角膜上皮細胞特異性標(biāo)記物K12表達陽性，鱗狀上皮細胞標(biāo)記物K14表達陰性。然后將誘導(dǎo)后的上皮祖細胞移植到以n-庚醇制備的角膜損傷小鼠模型，移植后24h可見受損角膜重新上皮化，修復(fù)細胞來源于移植的干細胞。有趣的是部分移植細胞呈現(xiàn)基底細胞或翼細胞外觀，說明移植細胞同時出現(xiàn)了非角膜上皮細胞的特性。由此可見，對于雙眼完全性角膜緣干細胞缺乏的病例，ESCs很有可能為角膜緣干細胞移植和眼表重建提供充足的細胞來源。
2.2胚胎干細胞與晶狀體 目前，人工晶狀體植入在白內(nèi)障治療中得到世界范圍的廣泛應(yīng)用，其手術(shù)方法的安全性是明確的，但是術(shù)后的調(diào)節(jié)問題一直沒有得到很好的解決。2003年，國外研究者[13]以基質(zhì)細胞來源的誘導(dǎo)活性(stromal cell-derived inducing activity, SDIA)為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)猴ESCs分化成晶狀體細胞，20d后細胞聚集成群，最終形成不同大小的透明體，具有三維結(jié)構(gòu)，免疫組化和Western blot檢測顯示αA晶狀體蛋白和Pax6陽性。一些細胞群內(nèi)可見色素上皮細胞的存在。同時，晶狀體細胞的數(shù)量隨FGF-2濃度和ESCs集落密度的增加而增多。因此，將ESCs誘導(dǎo)成晶狀體細胞，植入到晶狀體摘除術(shù)后的囊?guī)?nèi)，是替代人工晶狀體治療白內(nèi)障的一個可能途徑，而且可以很好的解決術(shù)后調(diào)節(jié)問題。
2.3胚胎干細胞與視網(wǎng)膜 在眼科領(lǐng)域的研究中，ESCs移植尚處于實驗研究階段，其在視網(wǎng)膜變性疾病及視神經(jīng)病變治療中的應(yīng)用潛能逐漸成為研究的熱點。ESCs既可以作為視網(wǎng)膜神經(jīng)元發(fā)育機制研究的良好模型，也可以為視網(wǎng)膜變性疾病進行細胞移植提供充足的資源。Schraermeyer 等[14]將ESCs移植至RCS(Royal College of Surgeons)大鼠的視網(wǎng)膜下腔,結(jié)果發(fā)現(xiàn)未進行ESCs移植的對照組視網(wǎng)膜外核層細胞發(fā)生變性而ESCs移植組外核層仍保留8排左右細胞,說明移植ESCs能延緩視網(wǎng)膜感光細胞的變性。
Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ESCs經(jīng)體外誘導(dǎo)后可以分化成表達光感受器細胞特異性標(biāo)志的細胞，但不呈現(xiàn)光感受器細胞的形態(tài)，可能與未同時進行細胞分化和形態(tài)學(xué)分化誘導(dǎo)有關(guān)。Hara等[16]將ESCs移植入成年小鼠玻璃體腔內(nèi)，分別在移植后5d和3d進行形態(tài)學(xué)和凋亡檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在移植后5d，ESCs呈未分化狀態(tài)，不表達神經(jīng)元標(biāo)記物，且大量細胞凋亡。而移植后30d未檢測到凋亡細胞，其中一部分細胞沿視網(wǎng)膜內(nèi)表面分化呈現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)，位于神經(jīng)節(jié)細胞層，并形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，且表達與宿主神經(jīng)節(jié)細胞相似的神經(jīng)元標(biāo)記物;而另一部分遠離視網(wǎng)膜表面的細胞則形成了畸胎瘤，說明ESCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)元分化需要視網(wǎng)膜微環(huán)境的誘導(dǎo)。而Meyer等[17]將小鼠ESCs在體外用視黃酸誘導(dǎo)為神經(jīng)祖細胞后，移植至rd1鼠玻璃體腔后進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植細胞大部分分布在視網(wǎng)膜內(nèi)界膜，少數(shù)細胞整合至視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)從狀層，移植細胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣表型，且表達神經(jīng)元和突觸特異性標(biāo)記物，說明視網(wǎng)膜特異性微環(huán)境對ESCs向神經(jīng)元分化也具有誘導(dǎo)作用，且分化后的神經(jīng)元可能與宿主神經(jīng)元建立了突觸聯(lián)系。但其具體的誘導(dǎo)分化機制，以及是否成功的進行了功能重建還需進一步研究。
最近，Haruta等[18]將猴ESCs誘導(dǎo)分化成為色素上皮細胞，分化后的細胞在形態(tài)上呈六角形，富含色素，頂端具有微絨毛，細胞間形成緊密連接，而且具有非特異性吞噬功能。隨后他們將由這種ESCs獲得的色素上皮細胞移植入4wk齡的RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔，8wk后分析表明移植細胞具有正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞的形態(tài)，而且對光感受器細胞具有一定的保護作用。研究者同時還對移植鼠進行了行為學(xué)檢測，結(jié)果顯示移植鼠的視功能得到了很好的保存。最近，有學(xué)者將ESCs在體外誘導(dǎo)形成含有色素上皮前體細胞的eye-like結(jié)構(gòu)，并移植至雞胚的視泡內(nèi)，可見視網(wǎng)膜色素上皮細胞單層的形成，表明移植結(jié)構(gòu)在體內(nèi)可以定向的分化為成熟的類色素上皮細胞[19]。此外，人ESCs也可誘導(dǎo)分化成色素上皮細胞，具有正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞的形態(tài)和非特異性吞噬功能，表達色素上皮細胞特異性標(biāo)記物，同時還可轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元細胞，經(jīng)多次傳代后又可重新分化為類色素上皮細胞。讓人感興趣的是，這些由ESCs誘導(dǎo)分化來源的色素上皮細胞與視網(wǎng)膜色素上皮組織在基因表達上具有高度的相似性，其相似性高于目前已經(jīng)建系的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞D407和ARPE-19[20]。這為研究視網(wǎng)膜色素上皮細胞失代償引起的視網(wǎng)膜變性的發(fā)病機制、藥物治療的開發(fā)和細胞替代治療提供了無窮資源。
3存在問題
ESCs的成瘤性是目前ESCs移植面臨的困難之一。Arnhold等[21]在移植后的長期觀察中，50%的移植眼可以看到畸胎瘤的形成，并侵犯宿主的視網(wǎng)膜，甚至是全眼球受累。這說明ESCs的無限自我更新和高分化潛能在移植后有形成腫瘤的危險，這就要求在使用ESCs進行治療前，必須先進行體外誘導(dǎo)ESCs分化產(chǎn)生某種特定的組織細胞或設(shè)計自殺基因，當(dāng)移植的細胞向腫瘤發(fā)展時，自殺基因能啟動自毀程序使其凋亡。而且如何控制ESCs分裂增殖中的突變，產(chǎn)生正常的分化細胞仍需大量實驗研究。此外，ESCs的倫理學(xué)問題也仍然是目前的爭論焦點之一。
總之， ESCs的自身應(yīng)用優(yōu)勢雖然為難治性眼科疾病的治療提供了新的途徑，但也存在著大量有待解決的問題。因此，闡明ESCs的定向分化機制、明確向目的細胞分化的誘導(dǎo)條件、基因修飾ESCs將是未來ESCs研究的發(fā)展方向。
【參考文獻】
1 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science ,1998;282:1145-1147
2 Eiges R, Benvenisty N. A molecular view on pluripotent stem cells. FEBS letters ,2002;529:135-141
3 Verfaillie CM, Pera MF, Lansdorp PM. Stem cells: hope and reality. Hematology ,2002;1:369-391
4 Amit M, Carpenter MK, Inokuma MS, Chiu CP, Harris CP, Waknitz MA, Itskovitz-Eldor J, Thomson JA. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev Biol ,2000;227:271-278
5 Pera MF, Reubinoff B, Trounson A. Human embryonic stem cells. J Cell Sci ,2000;113(1):5-10
6 Dahéron L, Opitz LS, Zaehres H, Lensch WM, Andrews PW, Itskovitz-Eldor J, Daley GQ. LIF/ STAT3 signaling fails to maintain self-renewal of human embryonic stem cells. Stem Cells ,2004;22:770-778
7 Humphrey RK, Beattie GM, Lopez AD, Bucay N, King CC, Firpo MT, Rose-John S, Hayek A. Maintenance of pluripotency in human embryonic stem ceils is STAT3 independent. Stem Cells ,2004;22:522-530
8 Dua HS, Azuara-Blanco A. Autologous limbal transplantation in patients with unilateral corneal stem cell deficiency. Br J Ophthalmol ,2000;84:273-278
9 Nishida K, Yamato M, Hayashida Y, Watanabe K, Yamamoto K, Adachi E, Nagai S, Kikuchi A, Maeda N, Watanabe H, Okano T, Tano Y. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N Engl J Med ,2004;351(12):1187-1196
10王智崇,葛堅,陳家祺,黃冰.角膜基質(zhì)誘導(dǎo)胚胎干細胞定向分化的初步實驗研究.眼科學(xué)報,1999;15(4):195-198
11 Yu L, Ge J, Wang Z, Huang B, Yu K, Long C, Chen X. The preliminary experimental study of induced differention of embryonic stem cells into corneal epithelial cells. Eye Sci ,2001;17(3):138-143
12 Homma R，Yoshikawa H，Takeno M，Kurokawa MS, Masuda C, Takada E, Tsubota K, Ueno S, Suzuki N. Induction of Epithelial Progenitors In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells and Application for Reconstruction of Damaged Cornea in Mice. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2004;45(12):4320-4326
13 Ooto S, Haruta M, Honda Y, Kawasaki H, Sasai Y, Takahashi M. Induction of the Differentiation of Lentoids from Primate Embryonic Stem Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2003;44(6):2689-2693
14 Schraermeyer U, Thumann G, Luther T, Kociok N. Subretinally transplanted embryonic stem cells from degeneration in the RCS rats. Cell Transplant ,2001;10(8):673-680
15 Zhao X, Liu JN, Ahmad I. Differentiation of embryonic stem cells into retinal neurons. Biochem Biophys Res Commun ,2002;(297):177-184
16 Hara A, Niwa M, Kunisada K, Yoshimurad N, Katayamaa M, Kozawab O, Moria H. Embryonic stem cells are capable of generating a neuronal network in the adult mouse retina. Brain Research ,2004;999(2):216-221
17 Meyer JS, Katz ML, Maruniak JA, . Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in vitro and after transplantation into eyes of mutant mice with rapid retinal degeneration. Brain Research ,2004;(1014):131-144
18 Haruta M, SasaiY, Kawasaki H, Amemiya K, Ooto S, Kitada M, Suemori H, Nakatsuji N, Ide C，Honda Y, Takahashi1 M. In Vitro and In Vivo Characterization of Pigment Epithelial Cells Differentiated from Primate Embryonic Stem Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2004;45:1020-1025
19 Aokia H, Harab A, Nakagawa S， Motohashia T, Hiranod M, Takahashie Y, Kunisadaa T. Embryonic stem cells that differentiate into RPE cell precursors in vitro develop into RPE cell monolayers in vivo. Exp Eye Res , 2006;(82):265-274
20 Klimanskaya I, Hipp J, Rezai KA, West M, Atala A, Lanza1 R. Derivation and Comparative Assessment of Retinal Pigment Epithelium from Human Embryonic Stem Cells Using Transcriptomics. Cloning and stem cells , 2004;(3):217-245
21 Arnhold S, Klein H, Semkova I, Addicks K, Schraermeyer U. Neurally Selected Embryonic Stem Cells Induce Tumor Formation after Long-Term Survival following Engraftment into the Subretinal Space. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2004;(45):4251-4255
|