作者：毛俊峰，劉雙珍，秦文娟，黃瑞堯，李鳳云，吳小影 作者單位：中南大學湘雅醫(yī)院 眼科，湖南 長沙 410008
【摘要】 目的 研究豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞原代培養(yǎng)的方法。方法 用半透明眼罩遮蓋法建立豚鼠的近視眼模型。采用酶消化法培養(yǎng)豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞，用倒置相差顯微鏡觀察Müller細胞的生長狀況，以GFAP、Vimentin免疫組化染色進行細胞鑒定。結(jié)果 半透明眼罩遮蓋豚鼠右眼2周后，遮蓋眼眼軸延長，近視形成。原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細胞貼壁生長，胞體較大、扁平，GFAP、Vimentin免疫組化染色呈陽性。結(jié)論 酶消化法是培養(yǎng)豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞的一種有效方法。
【關(guān)鍵詞】 視網(wǎng)膜;Müller細胞;近視眼;豚鼠
Müller細胞是視網(wǎng)膜最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，與視網(wǎng)膜三級神經(jīng)元共同構(gòu)成“神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)”調(diào)控網(wǎng)絡，參與視網(wǎng)膜的生理、病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，Müller細胞能合成一些與近視眼發(fā)生密切相關(guān)的視網(wǎng)膜因子，如堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)[1]、多巴胺(dopamine， DA)[2]、視黃酸(retinoic acid，RA)[3]、轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)[4]，但是，目前尚不明確Müller細胞在近視眼形成中的具體作用及機制。豚鼠是目前國內(nèi)研究近視眼的常用實驗動物[5-7]，因此，我們建立豚鼠形覺剝奪性近視眼模型，探索其視網(wǎng)膜Müller細胞的培養(yǎng)方法及生長特性，為下一步研究Müller細胞與近視眼的關(guān)系打下基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 豚鼠近視眼模型制作 3～4周齡的斷乳三色豚鼠24只(清潔級，中南大學動物部提供)，體重200～220 g，雌雄不限。隨機取其中12只，以0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，用自制半透明眼罩(材料為乳白色乳膠手套)遮蓋右眼，縫4針固定于眼眶周圍組織，以對側(cè)未遮蓋眼作自身對照。以剩余12只豚鼠的右眼作正常對照。遮蓋2周后，去除眼罩，用0.5%托吡卡胺擴瞳驗光測眼球屈光度，以A型超聲測量眼軸長度，測3次，取平均值。
1.2 豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞的培養(yǎng) 近視眼豚鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，用75%酒精浸泡消毒5 min。在超凈工作臺內(nèi)摘除豚鼠眼球，清除眼球外筋膜組織，用D-Hanks液漂洗3次。沿角膜緣后1 mm剪開眼球壁，去除眼前段，分離出神經(jīng)視網(wǎng)膜，洗凈附著的色素上皮。將其移入完全培養(yǎng)液(100 ml完全培養(yǎng)液由DMEM 80 ml、20%胎牛血清20 ml、青霉素100 μg/ml、鏈霉素100 μg/ml組成)中，用眼科顯微剪刀把神經(jīng)視網(wǎng)膜剪成小碎片，以0.25%胰蛋白酶消化10 min，用吸管吹打，制成細胞懸液。每1只眼球的視網(wǎng)膜接種于1個50 ml(25 cm2)培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5% CO2的自動培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后首次換液，去除懸浮細胞，以后每3～4 d換液1次，待細胞匯合成片、貼壁細胞達80%以上時按1：2傳代。每天用倒置相差顯微鏡觀察Müller細胞的生長狀況。
1.3 豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞的免疫組化染色 在6孔板中預先放入蓋玻片，取第2代細胞接種其上，待細胞基本融合時取出，用D-Hanks液清洗，用4%多聚甲醛固定30 min后用于免疫組化染色。主要步驟如下：①3%過氧化氫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。②5%正常山羊血清封閉室溫下作用10 min。③一抗GFAP多抗(Santa Cruz公司，濃度1：100)、Vimentin多抗(Santa Cruz公司，濃度1：100)于4℃過夜。④生物素標記二抗工作液于37℃孵育30 min。⑤辣根酶標記鏈霉卵白素工作液于37℃孵育30 min。⑥以DAB顯色，蘇木素復染，在顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照。
1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，對遮蓋眼與對照眼的屈光度、眼軸長度進行t檢驗。
2 結(jié)果
2.1 豚鼠近視眼模型 遮蓋2周后，豚鼠遮蓋眼眼軸延長，近視形成。其屈光度為(-2.08±0.20)D，與自身對照眼(+1.67±0.15)D、正常對照眼(+1.55±0.20)D比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=52.08、44.27，P<0.05);遮蓋眼眼軸長度為(8.42±0.16)mm，與自身對照眼(8.06±0.13)mm、正常對照眼(8.10±0.11)mm比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.05、5.71，P<0.05)。
2.2 豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞的生長特性 原代培養(yǎng)接種24 h后，部分視網(wǎng)膜細胞貼壁，部分細胞呈橢圓形，有的堆積成團。首次換液去除大部分混雜細胞(如神經(jīng)節(jié)細胞、光感受器細胞、雙極細胞等)，貼壁的Müller細胞分裂旺盛，長出小突起，伸展，胞體飽滿。10 d后，Müller細胞形態(tài)基本穩(wěn)定，胞體較大、扁平，呈三角形、多角形或梭形等，折光性暗，胞核多為橢圓形，位于胞體中央或略偏位(見圖1)。一般30～35 d后Müller細胞融合成片，相互交錯或平行排列，進行傳代。傳代細胞多在15～20 d基本融合。第3代Müller細胞形態(tài)基本不變，生長速度減慢，細胞開始老化。第4代細胞基本停止生長，死亡速度明顯加快。
2.3 豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞的免疫組化染色 90%以上的培養(yǎng)細胞陽性表達GFAP(見圖2)和Vimentin(見圖3)，這些細胞的胞漿內(nèi)有大量棕黃色顆粒，在胞核附近顆粒密度較高。以PBS代替一抗作陰性對照者(見圖4)，細胞內(nèi)無GFAP和Vimentin免疫反應著色。
3 討論
近視眼發(fā)病機制的研究是目前眼科領(lǐng)域的研究熱點之一，目前已公認近視眼的發(fā)生是在視網(wǎng)膜調(diào)控下鞏膜主動重塑的結(jié)果[8-9]。目前，研究較多的參與近視眼調(diào)控的視網(wǎng)膜因子有RA、DA、血管活性腸肽、bFGF、TGF-β2等[9]。Müller細胞及其突起廣泛分布于視網(wǎng)膜各類神經(jīng)元胞體及神經(jīng)纖維之間，與神經(jīng)元相互作用，在視網(wǎng)膜的功能活動中發(fā)揮重要作用。Müller細胞感受視網(wǎng)膜神經(jīng)元信號，調(diào)節(jié)神經(jīng)元活性，與其能合成、分泌多種神經(jīng)活性物質(zhì)及表達多種信號因子的受體有關(guān)。體外研究表明，視網(wǎng)膜Müller細胞能合成DA、RA、bFGF、TGF-β2和表達bFGF的受體FGFR-1、DA受體、RA受體[1-4]。但Müller細胞是否能通過調(diào)控這些視網(wǎng)膜因子的表達，參與近視眼發(fā)生尚有待證實。因此，探索豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞的培養(yǎng)條件具有重要意義。目前，視網(wǎng)膜Müller細胞的培養(yǎng)方法主要有組織塊法和酶消化法兩種。我們采用酶消化法成功地培養(yǎng)出豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞，并用GFAP、Vimentin免疫組化染色加以證實。本研究中，近視眼豚鼠的平均年齡是5～6周齡，其視網(wǎng)膜Müller細胞生長速度較慢，第1代細胞需30～35 d才能基本融合，傳代細胞融合也需15～20 d。與近視眼豚鼠相比，成年人、大鼠和小鼠視網(wǎng)膜Müller細胞的培養(yǎng)周期相對較短，第1代細胞一般需2～4周就能融合[10-11]。另外，豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞衰老較快，第3代細胞生長速度明顯減慢。因此，進行GFAP、Vimentin免疫組化染色時，我們選用第2代細胞。鑒于豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞的生長特點，要想快速獲得大量目的細胞用于科學研究有一定難度，因此，有必要繼續(xù)改進其培養(yǎng)方法，譬如加入飼養(yǎng)細胞[12]、使用條件化培養(yǎng)基[11]等，進一步加快Müller細胞的培養(yǎng)速度，這都有待進一步研究證實。
視網(wǎng)膜細胞成分比較復雜，包含三級神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、周細胞等，因此，Müller細胞的原代培養(yǎng)離不開細胞的純化。豚鼠視網(wǎng)膜無血管，避免了血管內(nèi)皮細胞和周細胞的混入，取材時仔細分離神經(jīng)視網(wǎng)膜并反復清洗，盡可能減少摻入視網(wǎng)膜色素上皮細胞。視網(wǎng)膜神經(jīng)元無分裂增殖能力，且不能貼壁生長，只能附著于Müller細胞表面，換液、傳代后即可消失。通過GFAP、Vimentin免疫組化染色可知，我們獲得的豚鼠近視眼視網(wǎng)膜Müller細胞的純度在90%以上。
綜上所述，我們采用酶消化法成功培養(yǎng)出豚鼠近視眼Müller細胞，有助于為以后研究視網(wǎng)膜Müller細胞與近視眼的關(guān)系提供目的細胞。
【參考文獻】
[1] Harada T， Harada C， Kohsaka S， et al. Microglia-Müller glia cell interactions control neurotrophic factor production during light-induced retinal degeneration[J]. J Neuro Sci，2002，22(21)：9228-9236.
[2] Kubrusly RC， Cunha MC， Reis RA， et al. Expression of functional receptors and transmitter enzymes in cultured Müller cells[J]. Brain Res，2005，1038(2)：141-149.
[3] Edwards RB， Adler AJ， Claycomb RC. Synthesis of retinoic acid from retinol by cultured rabbit Müller cells[J]. Exp Eye Res，1992，54(4)：481-490.
[4] Eichler W， Yafai Y， Wiedemann P， et al. Angiogenesis-related factors derived from retinal glial (Müller) cells in hypoxia[J]. Neuroreport，2004，15(10)：1633-1637.
[5] 程振英，李鏡海，李榮，等. 形覺剝奪時限對豚鼠近視形成的影響[J]. 中華眼科雜志，2004，40(3)：183-185.
[6] 毛俊峰，劉雙珍，魏欣，等. 激活蛋白-1誘騙寡核苷酸對豚鼠近視眼形成的影響[J]. 眼視光學雜志，2006，8(6)：364-366.
[7] 胡文政，褚仁遠，張利能. 豚鼠實驗性近視眼鞏膜的羥脯氨酸含量改變[J]. 眼視光學雜志，2001，3(2)：103-104.
[8] McBrien NA， Gentle A. Role of the sclera in the development and pathological complications of myopia[J]. Prog Retin Eye Res，2003，22(3)：307-338.
[9] Nastri G， Sellitti L， Benusiglio E. Experimental myopia：the role of the retina (Part Ⅰ)[J]. InterNet J Ophthalmol，1998，3(1)：1-21.
[10] Lupien C， Brenner M， Guérin SL， et al. Expression of glial fibrillary acidic protein in primary cultures of human Müller cells[J]. Exp Eye Res，2004，79(3)： 423-429.
[11] 彭廣華，李志杰，李辰. 視網(wǎng)膜Müller細胞原代培養(yǎng)的技術(shù)研究[J]. 眼科研究，1998，16(1)：13-15.
[12] 張宇明，陳永振，江黎明. 不同細胞飼養(yǎng)層對HL-60白血病細胞株增殖分化的影響[J]. 河北醫(yī)學，2004，10(8)：745-748.