【摘要】 目的 為了解喉鱗癌中人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus, HPV）HPV-E1亞基因片段的發(fā)生發(fā)展及其作用。方法 采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)對臨床活體組織中HPV-E1的表達進行病毒病因?qū)W研究，所采用的公共產(chǎn)物代表HPV13個亞型。喉鱗癌25例，臨床病理分級(UICC,1992)為：Ⅰ級5例，Ⅱ級15例，Ⅲ3例，Ⅳ2例。正常喉組織6例。結(jié)果 25例喉鱗狀細胞癌中HPV-E1亞基因片段出現(xiàn)率為68％(17/25)，6例正常喉組織全部為陰性結(jié)果，統(tǒng)計學處理P＜0.01。結(jié)論 某些喉鱗癌中存在HPV-E1的感染，但感染與否與喉鱗癌臨床病理分級無關。
Study On the association between squamous cell carcinoma of larynx and HPV subgene by PCR
WANG Jiqun, ZHANG Tao, ZHANG Faqi.Department of Otorhinolaryngology ， the First Affiliated Hospital, Medical College of Jinan University,Guangzhou 510630
【Abstract】 Objective To measure the human papilloma virus（HPV）HPV-E1 in squamous cell carcinoma of larynx. Methods Polymerase chain reaction（PCR）was used to detect the HPV subgene in 25 specimens of laryngeal carcinoma and 6 normal larynges. Results Positive expression of HPV-E1 was detected in 17 of 25 cases(68％)with squamous cell carcinoma and all the recurrent cases. However, there was no positive expression of HPV-E1 in the normal larynges (P＜0.01). The expression rate was not significantly different among the histological grad groups.Conclusion HPV-E1 infection was found in laryngeal carcinoma but not related to its histologic grading.
【Key words】 Laryngeal neoplasms Genes,viral Polymerase chain reaction Papillama virus,human Oncogenes
人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus, HPV）與頭頸腫瘤及某些生殖道腫瘤有密切關系。HPV感染與喉鱗癌的關系國內(nèi)已有報道［1,2］。我們采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)進行了HPV亞基因序列E1與喉鱗狀細胞癌之間的相關研究。
材料及方法
一、組織標本來源
喉鱗癌來自門診和住院患者的活組織檢查和手術(shù)切除的腫瘤組織，共25例，臨床病理分級(UICC) 為：Ⅰ級5例，Ⅱ級15例，Ⅲ級3例，Ⅳ級2例。已有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者6例。6例正常喉組織取自非正常死亡的健康人。所有標本取下后一部分送病理學檢查，另一部分立即放入液氮中保存。
二、主要試劑及PCR引物設計
1.PCR引物設計采用Willem 等設計的E1區(qū)序列(代表1a,5,6p,8,11,16,18,31, 33等13個亞型的公共引物)［3］：
GP1+5'TGGTACAATGGGCATATGAT3'
GP2-5'AATGGCTTTTGGAATTTACA3'
Taq酶及dNTP等主要生物試劑購于華美生物工程公司及中國醫(yī)學科學院。
三、實驗方法
1.組織DNA膜板的提?。悍Q取低溫保存的組織200 mg，剪碎勻漿，消化；用飽和酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)混合液抽提，無水乙醇沉淀、離心，最后將DNA溶于滅菌的等離子水中，測量DNA的含量。
2.PCR步驟：反應總體積為50 μl，其中50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl2， 2 單位Taq 酶及50 pmol/L prinmers。首先將模板DNA 100℃加熱變性10 min，然后進入反應體積。PCR溫變條件為變性94℃，1 min；退火42℃，2 min；延伸72℃,2 min。40個周期。
陽性對照用全組HPV-DNA做模板，陰性對照設3組，第一組為模板加離子水，第二組為模板加引物，第三組為Taq酶加模板。電泳，HE染色，觀察結(jié)果。
結(jié)果
25例喉鱗狀細胞癌中含HPV-E1片段者占68％(17/25)，17例陽性者中臨床分級：Ⅰ級2例，Ⅱ級2例，Ⅲ2例，Ⅳ1例。6例正常喉組織中未見有HPV-E1片段（圖1）。
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圖1 N1為陽性對照，N2～N18為喉鱗癌HPV-E1陽性結(jié)果。N19～N21為陰性對照。M1為DNA標 尺(PBR322－HeaⅢ，第一條帶含444bp)
討論
Seedorf等［4］的結(jié)果認為，HPV-DNA基因呈環(huán)狀，含有9個主要開放讀碼(majar open reading frame),即E1～E7、L1～L2。在L1和E6 之間存在著病毒長期控制的基因區(qū)，可能起著病毒轉(zhuǎn)錄和復制的調(diào)節(jié)作用，唯一的促進子在HPV-DNA的起始段。HPV-DNA環(huán)上含有兩個轉(zhuǎn)錄基因片段，第4000bp之后的稱早期轉(zhuǎn)錄基因，第7000bp之后的稱晚期轉(zhuǎn)錄基因。HPV-DNA復制呈順時針方向進行。Schwarz 等［5］報道，宮頸癌細胞株中HPV16和HPV18兩種DNA序列部分或完全地整合部位以E1、E2基因片段為多。宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)病灶，HPV-DNA通常在核內(nèi)呈游離狀態(tài)，在浸潤性癌中則呈整合狀態(tài)，或整合、游離共存［6］，這說明HPV-DNA-E1整合與病灶轉(zhuǎn)化和浸潤性癌有關。因此，在喉鱗癌中HPV-E1片段的數(shù)量及所出現(xiàn)的比率具有重要性。Howley 等［6］認為HPV-DNA整合引起病毒E2基因的缺失，使E2基因調(diào)節(jié)病毒長期控制區(qū)功能喪失。E2的缺失則導致E6和E7基因的表達失控，從而引起細胞的轉(zhuǎn)化或惡變。Choo等［7］認為E6和E7是潛在的癌基因，當E1整合E2 缺失時才能使其活化。本實驗結(jié)果表明，喉鱗癌同正常喉組織比較，HPV-E1 的感染率差異有顯著性(P＜0.01)，說明喉鱗癌中HPV-E1片段可能起非常重要的作用。 但與喉癌臨床病理分級無顯著性相關，可能HPV激活癌基因后即失去作用。 癌腫發(fā)展按癌基因的表達程序進行。
本組25例喉鱗癌中有2例為手術(shù)＋放射治療后復發(fā)的患者，二者均存在HPV-DNAE1基因片段，可能提示雖然放射線能殺死癌細胞，但不能清除HPV-E1片段。腫瘤的復發(fā)是否與HPV-E1的存在有關需繼續(xù)研究。發(fā)現(xiàn)有HPV感染的腫瘤，除化學治療、放射治療及手術(shù)治療外，應配合清除HPV 的治療，大多數(shù)HPV感染所致的病變目前尚無有效治療措施，這有可能是HPV感染病變和喉鱗癌逐年增多的原因之一。據(jù)報道普達非倫(podophyllin)的有效率為30％，α/β干擾素的有效率為50％，Depal試用人纖維母細胞干擾素(human fibroblast interfern) 效果比較滿意，其有效率可達60％左右。
本課題為國家自然科學基金項目（39300144）
參考文獻
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