【摘要】 目的 研究X射線照射對(duì)鼻咽癌CNE1細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)基因hMSH2表達(dá)的影響，探討放射損傷后腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制。方法 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)、免疫細(xì)胞化學(xué)及蛋白免疫印跡(Western blot)方法，檢測(cè)X射線照射后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(照射總劑量分別為0Gy和10Gy)細(xì)胞中hMSH2 基因mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞hMSH2 基因mRNA及蛋白表達(dá)在照射終止后逐漸上調(diào)，其表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論 X射線照射可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞hMSH2的表達(dá)，有助于放射損傷后腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)，這可能是腫瘤放療敏感性降低的原因之一。
【關(guān)鍵詞】 X射線 鼻咽癌 hMSH2; RTPCR 免疫細(xì)胞化學(xué)
0 引言
目前在惡性腫瘤放射治療中，常出現(xiàn)腫瘤放療敏感性降低的現(xiàn)象，這涉及到腫瘤本身的生物學(xué)特性及某些癌基因和抑癌基因的改變，但迄今為止尚未見(jiàn)到有關(guān)錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)基因在其中有何作用的報(bào)道。研究證實(shí)，MMR基因能夠糾正DNA復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的堿基錯(cuò)配，保證基因組的完整性和穩(wěn)定性，其中hMSH2基因在錯(cuò)配修復(fù)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[1]。本研究選用臨床上以放射治療為首選的鼻咽癌細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)、免疫細(xì)胞化學(xué)及蛋白免疫印跡(western blot)方法，檢測(cè)X射線照射后鼻咽癌CNE細(xì)胞中hMSH2 基因mRNA及蛋白表達(dá)，分析放射對(duì)hMSH2基因表達(dá)的影響，探討放射損傷后腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制，為增強(qiáng)腫瘤放療敏感性及指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 CNE1細(xì)胞株
CNE1細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海生物學(xué)研究所提供, 該細(xì)胞株的來(lái)源及生物學(xué)特性參見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。用含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、100%飽和濕度、95%空氣+5% CO2條件下的CO2 孵箱培養(yǎng)，常規(guī)傳代，待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2 照射條件及方法
取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按梯度稀釋法用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整到合適的細(xì)胞濃度，將其接種于數(shù)個(gè)培養(yǎng)瓶中，放置于CO2 孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁。照射源為6MV X直線加速器，劑量率為200cGy/min，射野大小為10cm×15cm, 把培養(yǎng)瓶置于照射野中心。照射前對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行衰減校正。將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每次照射劑量分別為0、2Gy，1次/天，總劑量分別為0、10Gy。每次照射后將細(xì)胞放回CO2孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，照射全部結(jié)束后立即收集兩組部分細(xì)胞，其余細(xì)胞每周收集1次，共收集5次，凍存?zhèn)溆谩?/span>
1.3 RTPCR方法檢測(cè)hMSH2 mRNA的表達(dá)
用Trizol試劑分別提取兩組細(xì)胞總RNA，經(jīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)構(gòu)成如下：RNA 1μg，隨機(jī)引物0.5μl,dNTP 1μl, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl, RNase 抑制劑0.25, Mgcl2 2μl,10×Buffer 1μl,加RNase滅活蒸餾水補(bǔ)充至10μl。PCR反應(yīng)系統(tǒng)構(gòu)成如下：5×PCR Buffer 10μl， TaKaRa Ex TaqTMHS 0.25μl, hMSH2基因及內(nèi)對(duì)照βactin上、下游特異性引物各0.5μl，加滅菌蒸餾水補(bǔ)充至40μl。從基因bank查出hMSH2和βactin的引物序列， hMSH2： 5′GTCGGCTTCGTGCGCTTCTTT3’，5′TCTCTGGCCATCAACTGCGGA3’，擴(kuò)增產(chǎn)物429bp;βactin： 5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG3’，5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3’，擴(kuò)增產(chǎn)物 621bp。引物由大連寶生物工程有限公司合成。擴(kuò)增條件：94℃ 5min，94℃ 30s，59℃ 30s ，72℃ 45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10min。取10μl PCR產(chǎn)物在2% 瓊脂糖凝膠電泳分離， UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描照相，計(jì)算hMSH2與βactin基因RTPCR產(chǎn)物吸光度的比值，以此作為hMSH2 mRNA的相對(duì)含量。
1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)hMSH2蛋白的表達(dá)
取兩組細(xì)胞涂片，參照試劑盒(Zymed公司)說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行鏈酶親和素過(guò)氧化物酶(streptavidinperoxidase, SP)法免疫細(xì)胞化學(xué)染色。鼠抗人hMSH2單克隆抗體(Zymed公司)使用時(shí)稀釋度為1∶50。用已知表達(dá)陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。光鏡下觀察到細(xì)胞核存在棕黃色顆粒為hMSH2陽(yáng)性。采用HPLAS100彩色圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞吸光度值。
1.5 Western blot法檢測(cè)hMSH2蛋白的表達(dá)
將兩組細(xì)胞分別加入200μl細(xì)胞裂解液(50mmol/L TrisHcl pH 8.0、150mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA、1% triton X100、1mmol PMSF)，沸水煮5min，冰浴上超聲粉碎，4℃離心5min(11 000rpm)，取出上清液，用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)進(jìn)行蛋白定量。取蛋白樣品50μg，采用SDSPAGE電泳進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(1:150)和二抗(1∶1 000)孵育，ECL顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。UVP成像分析系統(tǒng)掃描確定蛋白印跡條帶的光密度值，以此表示蛋白含量。
1.6 統(tǒng)計(jì)方法
采用SPSS10.0軟件包，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 hMSH2 mRNA的表達(dá)
對(duì)照組細(xì)胞hMSH2 mRNA的表達(dá)極弱。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞照射終止后第1～3周內(nèi)hMSH2 mRNA表達(dá)水平顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P< 0.01)，其中第3周hMSH2 mRNA表達(dá)最強(qiáng)，之后明顯減弱(見(jiàn)圖1，表1)。
M：DL2000 DNA marker;Lane 1：對(duì)照組;Lane 2～6：實(shí)驗(yàn)組照射后0～4w
圖1 RTPCR法檢測(cè)hMSH2 mRNA表達(dá)(略)
2.2 hMSH2蛋白的表達(dá)
免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法均顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞hMSH2蛋白的表達(dá)在照射終止后逐漸增強(qiáng)，第2～4周其表達(dá)顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.01)(圖2、3，表1)。
表1 RTPCR和Western blot法檢測(cè)hMSH2基因的表達(dá)(略)
a,b：與對(duì)照組比較，P<0.01
圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)hMSH2蛋白表達(dá)(略)
1：對(duì)照組; 2～6：實(shí)驗(yàn)組照射終止后0～4w
圖3 Western blot法檢測(cè)hMSH2蛋白表達(dá)(略)
3 討論
DNA 是輻射引起細(xì)胞死亡的主要靶分子。X射線作為一種電離輻射，可引起DNA結(jié)構(gòu)和功能的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。DNA的修復(fù)能力是影響細(xì)胞存活和死亡的主要原因，也直接影響到腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。研究表明，放射所致的DNA損傷至少有兩個(gè)修復(fù)途徑：重組修復(fù)和切除修復(fù)。其中DNA 損傷切除修復(fù)系統(tǒng)是一系列的酶，如嘌呤嘧啶內(nèi)切酶，修復(fù)聚合酶和連接酶等。細(xì)胞利用這些酶進(jìn)行DNA的錯(cuò)配修復(fù)等[4]。
自1993年以來(lái)，至少有hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS1和hPMS2 等6種MMR基因被分離克隆，其中 hMSH2基因被發(fā)現(xiàn)的最早。hMSH2基因位于染色體2P2122，基因組DNA全長(zhǎng)73Kb，含有16個(gè)外顯子。hMSH2蛋白參與組成hMutSα和hMutSβ二聚體，識(shí)別DNA復(fù)制中的錯(cuò)配堿基及插入缺失環(huán)，并與之結(jié)合，是完成DNA修復(fù)必需的組件之一[5,6]。人體消化道、生殖腺等部位的細(xì)胞DNA復(fù)制活躍，需要MMR系統(tǒng)不斷糾錯(cuò)，因此 MMR基因通常有較高的表達(dá)。同樣，腫瘤細(xì)胞由于增殖異常活躍，MMR基因的表達(dá)也較強(qiáng)。
目前關(guān)于鼻咽癌與MMR基因的研究不多，而有關(guān)放療對(duì)鼻咽癌細(xì)胞MMR基因影響的報(bào)道也極少。本研究從mRNA和蛋白兩個(gè)水平研究hMSH2基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞hMSH2基因mRNA和蛋白均存在表達(dá)，說(shuō)明鼻咽癌細(xì)胞中存在DNA復(fù)制錯(cuò)誤，誘導(dǎo)MMR基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞hMSH2蛋白的表達(dá)在照射終止后逐漸增強(qiáng)并維持在較高水平，這說(shuō)明放射除了能造成DNA鏈斷裂以外，還能造成堿基錯(cuò)配，從而促使hMSH2蛋白表達(dá)代償性增強(qiáng)，以修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配，糾正DNA復(fù)制錯(cuò)誤，進(jìn)而保持遺傳信息的完整性和穩(wěn)定性，避免遺傳突變。另外，hMSH2蛋白表達(dá)的上調(diào)可能還與照射后細(xì)胞的加速再增殖有關(guān)。細(xì)胞在旺盛的增殖過(guò)程中容易產(chǎn)生DNA復(fù)制錯(cuò)誤，誘導(dǎo)hMSH2的表達(dá)。hMSH2 mRNA表達(dá)在照射終止后的前3周逐漸增強(qiáng)，這與蛋白變化一致，但第4周時(shí)表達(dá)明顯減弱。提示照射可引起hMSH2的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，使損傷的DNA逐漸被修復(fù)，但當(dāng)這種修復(fù)達(dá)到一定程度的時(shí)候，就會(huì)負(fù)反饋性地抑制其轉(zhuǎn)錄，因此出現(xiàn)hMSH2 mRNA水平的回落。hMSH2基因mRNA和蛋白表達(dá)的相對(duì)一致性提示hMSH2基因表達(dá)可能受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。但本研究中鼻咽癌細(xì)胞hMSH2表達(dá)的變化是否與放射引起的hMSH2基因本身的改變有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。
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