作者：朱國臣，肖大江，張亞男，吳四海，袁淵，黃紅宇，魏云玉
【摘要】 目的探討冬凌草甲素對人鼻咽癌細胞CNE2的抑制作用，為其臨床應用提供理論依據(jù)。方法SRB法檢測冬凌草甲素對CNE2細胞生長的抑制作用，流式細胞儀分析細胞周期的變化、檢測細胞凋亡的發(fā)生。結果冬凌草甲素抑制CNE2細胞的生長，引起細胞死亡;冬凌草甲素誘導CNE2細胞發(fā)生凋亡和壞死，流式細胞分析發(fā)現(xiàn)“亞G1期峰”;冬凌草甲素作用后CNE2細胞的G2/M期比例增多。結論 凋亡和壞死同為冬凌草甲素抑制CNE2細胞生長的機制，可能與改變細胞周期有關，且具有濃度依賴性。
【關鍵詞】 冬凌草甲素; 鼻咽癌; 凋亡; 壞死
Abstract：ObjectiveTo find more effectively chemotherapeutic agents and treatment regimens, we studied inhibiting effects of Oridonin on human nasopharyngeal cancer line CNE-2. MethodsCell growth inhibition mediated by Oridonin on CNE-2 cells was investigated by SRB assay. The effect of Oridonin on apoptotic induction in CNE-2 cells was determined by flow cytometry . ResultsThe growth of human nasopharyngeal cancer line CNE-2 was significantly inhibited by Oridonin in vitro, and the inhibition rates increased by increasing Oridonin concentration, and death cells were mainly necrotic cells and apoptotic cells . “SubG1” phase peak was found using flow cytometry . Oridonin could cause CNE 2 cells cycle to change. With the increase of drug concentration, G2/M phase cell percentage increased. ConclusionApoptosis and necrosis are the key mechanism for Oridonin's killing action in human nasopharyngeal cancer line CNE 2, which is partly due to change of cells cycle ,and appear to be dosedependent.
Key words：Oridonin; Human Nasopharyngeal Cancer; Apoptosis; Necrosis
冬凌草甲素(oridonin)是從冬凌草中提取出來的有效抗癌成分，其主要化學結構是一種四環(huán)二萜類化合物，有研究表明其對白血病以及食管癌、肝癌、結腸癌等有一定的療效[1～4]。本研究通過SRB法檢測細胞存活率、流式細胞儀分析細胞周期的變化、檢測細胞凋亡的發(fā)生等手段觀察冬凌草甲素對于人鼻咽癌細胞CNE2株的抑制作用，以期為臨床應用提供理論依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 材料和儀器 人鼻咽癌細胞系CNE2購于中國科學院上海細胞生物所，冬凌草甲素(純度>98%)購于中國科學院昆明植物研究所，Annexin V凋亡檢測試劑盒購于Biovision公司， PI(碘化丙啶)購于Sigma公司，熒光顯微鏡為Leica公司產品，流式細胞儀為Beckman Coulter公司產品。
1.2 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基為RPMI1640(美國Gibco BRL公司)，補充10%胎牛血清(杭州四季青公司)、100IU/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。細胞培養(yǎng)用50 ml培養(yǎng)瓶，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱在全濕條件下培養(yǎng)。
1.3 SRB法檢測細胞存活率將增殖良好并處于對數(shù)生長期的CNE2細胞經0.25%胰酶及EDTA各半的消化液分散后計數(shù)，制成細胞懸液，接種于96孔板內，100 μl/孔。預培養(yǎng)24 h后，每孔加入不同濃度的冬凌草甲素100 μl/孔(6.25，12.5，25，50，75，100，200 μmol/L)每個藥物濃度設6個復孔，并設空白對照(RPMI 1640培養(yǎng)液)和正常對照(不加藥物，加等量生理鹽水)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱在全濕條件下培養(yǎng)48 h。然后參照Skehan's法，取出培養(yǎng)板，每孔加入50%的三氯醋酸50μl固定細胞，然后在4℃冰箱中放置1 h。三蒸水洗滌、干燥后，每孔加入0.4%SRB100 μl，室溫下放置30 min，棄去各孔內液體后用1%乙酸洗滌5遍，干燥后用pH為10.5的10 mmol/L三羥甲基胺基甲烷溶解，在平板振蕩器上振蕩5 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定A值，用空白對照調零，所用波長509 nm。計算出藥物對細胞生長抑制率。生長抑制率=(對照組A值實驗組A值) /對照組A值×100%。
1.4 流式細胞儀檢測
1.4.1 Annexin V標記檢測收集不同濃度藥物作用后的細胞，分別制備成0.5 ml PBS單細胞懸液，先后加入凋亡試劑盒中Annexin VFITC和 PI各5 μl，室溫下避光染色10 min，上流式細胞儀檢測，軟件分析結果。未加藥組為對照組。
1.4.2 細胞周期檢測收集不同濃度藥物作用后的細胞，70%冷乙醇固定過夜，PBS清洗，200 μl RnaseA 37℃水浴消化30 min，800 μl PI避光染色30 min，上流式細胞儀進行細胞周期和凋亡峰檢測。未加藥組為對照組。
1.5 統(tǒng)計學分析
所得數(shù)據(jù)經SPSS 10.0 for windows 軟件處理，結果用±s表示。數(shù)據(jù)用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 冬凌草甲素對CNE細胞的細胞毒作用根據(jù)測得的A值，計算出冬凌草甲素在不同濃度下對CNE細胞的抑制率。冬凌草甲素取6.25，12.5，25，50，100，200 μmol/L濃度時，CNE細胞的抑制率分別為4.56%，13.78%，53.51%，68.92%，77.84%，91.26%?？梢钥闯龆璨菁姿貙NE-2細胞生長抑制率隨著濃度的增加而增加，冬凌草甲素的半數(shù)抑制率IR50為24.3 μmol/L。
2.2 冬凌草甲素對細胞凋亡的影響Annexin VFITC和 PI染色將細胞分為四種屬性，其中I象限：Annexin V低染、PI高染，為機械損傷細胞; II 象限：Annexin V和 PI均高染，為壞死細胞; III象限：Annexin V和 PI均低染，為正常細胞;IV象限：Annexin V高染、PI低染，為早期凋亡細胞。
冬凌草甲素處理后II ，IV象限的細胞數(shù)比例增多，且隨著藥物濃度的增加而逐漸增加，以 II 象限尤其明顯。結果見表1。表1 冬凌草甲素對CNE2細胞的Annexin V檢測(略)
2.3 冬凌草甲素對細胞周期的影響冬凌草甲素處理后在細胞周期G1峰前出現(xiàn)亞二倍體，即亞G1期峰(凋亡峰)，該期細胞數(shù)占檢測細胞的百分比，即為細胞發(fā)生凋亡的比例。亞G1期峰隨著藥物濃度的增加而逐漸明顯。12.5，25，50，100 μmol/L組的凋亡率分別為(0.6±0.2)%，(3.7±1.8)%，(5.9±1.6)%，(8.1±1.3)%，亞G1期峰隨著藥物濃度的增加而逐漸明顯。
正常狀態(tài)下的CNE2細胞大多數(shù)處于G1期，S期次之，G2/M期最少。冬凌草甲素處理后使細胞周期發(fā)生變化：G1期、S期細胞的比例減少，G2/M期細胞的比例增加，且隨著藥物濃度的增加而逐漸明顯。結果見表2。表 2 冬凌草甲素對CNE2細胞的PI檢測(略)
3 討論
大量的研究表明，冬凌草甲素具有廣泛的抗腫瘤作用，對多種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用。本研究表明，在體外條件下25 μmol/L以上的冬凌草甲素對鼻咽癌細胞CNE2具有明顯的抑制作用，并能誘導細胞發(fā)生死亡，且具有一定的量效關系。采用Annexin V標記和凋亡峰檢測等手段檢測凋亡，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對鼻咽癌細胞CNE2的凋亡作用不明顯，即使在高濃度(100 μmol/L)時凋亡比例并不很高，而壞死很明顯，故認為凋亡和壞死同為細胞死亡的主要機制，且以后者為主。
同時，本研究也發(fā)現(xiàn)不同濃度的冬凌草甲素作用于鼻咽癌細胞CNE2后，可出現(xiàn)細胞周期改變：G1期、S期細胞的比例減少，G2/M期細胞的比例增加。說明冬凌草甲素為細胞周期非特異性藥物，與文獻報道能延緩G2M期的移行和抑制細胞的有絲分裂，引起M早、中期細胞的阻斷，使G2，M期細胞聚集的結論相一致[4]，為臨床與放療聯(lián)合用于鼻咽癌的選擇提供理論依據(jù)。
【參考文獻】
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