【摘要】 目的 探討p14ARF、mdm2、p53蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)及其意義。方法 應(yīng)用免疫組化法檢測58例鼻咽癌組織和20例慢性鼻咽炎癥組織中p14ARF、mdm2、p53蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 p14ARF、mdm2、p53蛋白在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎癥組織中的陽性表達(dá)率分別為31.0%、41.4%、65.5%和100%、0、0，各個(gè)蛋白在兩組之間表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 p14ARF蛋白低表達(dá)以及mdm2、p53蛋白高表達(dá)與鼻咽癌有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 鼻咽癌；p14ARF；mdm2；p53
Abstract: Objective To investigate the role of p14ARF，mdm2，p53 protein in the process of carcinogenesis of nasopharyngeal carcinoma. Methods Expression of p14ARF，mdm2 and p53 protein were detected by immunohisto- chemical methods in 78 formalin-fixed and paraffin-embedded tissues, including nasopharyngeal carcinoma (n=58), chronic nasopharyngitis (n=20).Results positive rates of p14ARF，mdm2，p53 in patients with nasopharyngeal carcinoma and chronic nasopharyngitis were 31.0%、41.4%、65.5% and 100%，0，0，respectively. Expression of p14ARF protein were significantly decreased and mdm2，p53 protein were significantly elevated in nasopharyngeal carcinoma compared with chronic nasopharyngitis (P＜0.05). Conclusion The results suggested that p14ARF-mdm2-p53 cell cycle regulation pathway may play important roles in carcinogenesis of nasopharyngeal carcinoma and may be valuable markers in nasopharyngeal carcinoma diagnosis and therapy.
Key words: nasopharyngeal carcinoma；p14ARF；mdm2；p53
細(xì)胞周期的調(diào)控是由許多不同基因組成的多條通路來完成的。在人類腫瘤細(xì)胞中，最主要的細(xì)胞周期調(diào)控通路有兩條：RB通路(p16INK4a-CDK4/6-pRb- E2F)和p53通路(p14ARF-mdm2-p53)，近年來p14ARF- mdm2-p53通路的作用日益受到重視。本文應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)鼻咽癌中p14ARF、mdm2、p53蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測并分析各個(gè)蛋白表達(dá)與鼻咽癌之間的關(guān)系。
1 材料與方法
1.1 材料
研究材料取自2000-2005年我院鼻咽活檢標(biāo)本，共78例，其中鼻咽癌標(biāo)本58例(低分化鱗癌57例，未分化癌1例)，鼻咽黏膜慢性炎標(biāo)本20例；男45例，女13例；年齡12～79歲，平均49歲。所有病例診斷前未接受過抗癌治療。以上標(biāo)本均經(jīng)10％福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm切片。
兔抗人p14ARF多克隆抗體購自美國Neomarkers公司，稀釋度為1∶250；鼠抗人mdm2單克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體、即用型第二代免疫組化Elivisi onTM廣譜試劑盒、DAB顯色劑、多聚賴氨酸以及其他免疫組化輔助試劑均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。1.2 方法
免疫組織化學(xué)染色，按照說明書進(jìn)行。陰性對(duì)照以PBS代替一抗，陽性對(duì)照為已知陽性對(duì)照片。免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參考許良中［1］等的方法，在光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野記數(shù)細(xì)胞(鼻咽癌組織為癌細(xì)胞；慢性鼻咽炎癥組織為上皮細(xì)胞)。根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞數(shù)的百分比即陽性細(xì)胞百分比：染色強(qiáng)度打分：無色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分)；陽性細(xì)胞所占百分比打分：無陽性細(xì)胞(0分)，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%(1分)，11%～50%(2分)，51%～75%(3分)，＞75%(4分)；染色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞百分比得分得出最終結(jié)果：0～3分為陰性(-)，＞3分為陽性(+)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，率間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性比較采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 p14ARF蛋白表達(dá)
p14ARF以細(xì)胞核出現(xiàn)著色為陽性(圖1、2，見封2)。p14ARF蛋白在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎癥組織中的陽性表達(dá)率分別為31.0%、100%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。
2.2 mdm2蛋白表達(dá)
mdm2以細(xì)胞核出現(xiàn)著色為陽性，其中部分細(xì)胞漿也有著色(圖3，見封2)。mdm2蛋白在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎癥組織中的陽性表達(dá)率分別為41.4%、0，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。
2.3 p53蛋白表達(dá)
p53以細(xì)胞核出現(xiàn)著色為陽性(圖4，見封2)。p53蛋白在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎癥組織中的陽性表達(dá)率分別為65.5%、0，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。表1 鼻咽癌和慢性鼻咽炎癥中p14ARF、mdm2、p53蛋白的表達(dá)情況（略）
2.4 各蛋白表達(dá)相關(guān)性分析
Spearman相關(guān)分析表明，鼻咽癌組織中p14ARF、mdm2、p53表達(dá)均無相關(guān)性(P＞0.05)，見表2。表2 p14ARF與mdm2、p53蛋白表達(dá)的相關(guān)性（略）3 討論
p53基因是研究最多最活躍的抑癌基因之一，至少50%以上的人類腫瘤存在p53基因高頻率突變失活。從對(duì)原發(fā)性鼻咽癌標(biāo)本的研究來看，鼻咽癌中p53基因的突變情況不同于其他腫瘤。大部分報(bào)道指出鼻咽癌存在野生型p53而很少突變［2］。但大量的研究顯示：鼻咽癌組織和鼻咽癌細(xì)胞株有p53蛋白過表達(dá)或稱為聚集。本研究顯示鼻咽癌及慢性鼻咽炎癥組織中p53蛋白陽性表達(dá)率分別為65.5%和0，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［3-4］。
小鼠雙微粒體mdm2(mouse double minute 2)基因最初是從鼠自發(fā)轉(zhuǎn)化3T3成纖維細(xì)胞雙微染色體基因擴(kuò)增的篩選中發(fā)現(xiàn)的，是一種進(jìn)化上保守的癌基因。正常情況下，p53誘導(dǎo)mdm2 基因轉(zhuǎn)錄，mdm2蛋白和p53 結(jié)合使其失活并促進(jìn)p53 降解，形成了負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，因而在正常細(xì)胞中野生型p53 蛋白和mdm2 互相調(diào)節(jié)保持精細(xì)的平衡并處于低水平。mdm2在鼻咽癌中的作用目前研究資料較少，有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)dm2在鼻咽癌組織中的主要活化方式是過表達(dá)而不是擴(kuò)增［5］。
本研究結(jié)果顯示mdm2蛋白在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎癥組織中的陽性表達(dá)率分別為41.4%和0，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與廖芝玲等［6］等的研究結(jié)果基本一致。此外，本研究結(jié)果顯示mdm2、p53蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率分別為41.4%、65.5%，其中mdm2陽性的病例中p53的陽性率為75%。
鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)的mdm2蛋白可能有類似于某些病毒蛋白產(chǎn)物的作用，它與野生型p53蛋白結(jié)合后，可使其半衰期延長，因而免疫組化容易檢測到。而高表達(dá)的野生型p53蛋白又可調(diào)節(jié)mdm2蛋白的表達(dá)使其表達(dá)水平進(jìn)一步提高，因而出現(xiàn)這兩個(gè)基因在表達(dá)水平之間的高度相關(guān)性。這種高度相關(guān)性可以解釋某些鼻咽癌組織中為何只出現(xiàn)p53蛋白的高表達(dá)而沒有p53基因突變這一現(xiàn)象，同時(shí)也提示，mdm2可能通過野生型p53蛋白在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。
p14ARF是由p16INK4a的可變讀碼框架ARF(alternative reading frame)編碼，它與INK4a共享Exon2和Exon3，取代Exonl α的是位于其上游約20kb的Exonl β，三個(gè)外顯子共同編碼的p14ARF蛋白是一種核蛋白，位于核仁和(或)核內(nèi)包涵體中［7］，該蛋白相對(duì)十分穩(wěn)定，半衰期接近6h，主要經(jīng)過蛋白酶體途徑降解。
p14ARF作為抑癌基因，其功能失活的機(jī)制主要包括基因的突變、缺失和甲基化。p14ARF的功能失活則導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，大量研究表明肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、胰腺癌、黑色素瘤、喉癌等中均有p14ARF的表達(dá)缺失。但國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道p14ARF高表達(dá)于幾乎所有宮頸癌中。究其原因，可能與宮頸癌中高危型HPV E6、E7癌蛋白有關(guān)。
Kwong等［8］應(yīng)用甲基化特異性PCR對(duì)4個(gè)鼻咽癌細(xì)胞株、4個(gè)異種移植瘤、33例鼻咽癌組織和6例正常鼻咽組織的研究發(fā)現(xiàn)p14ARF的啟動(dòng)子甲基化率分別為25%、25%、18%和0。李永強(qiáng)［9］等報(bào)道p14ARF蛋白在36例晚期鼻咽鱗癌中陽性表達(dá)率為44.4%。本研究顯示該蛋白在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎癥組織中的陽性表達(dá)率分別為31.0%、100%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
另外，本研究采用Spearman相關(guān)分析未發(fā)現(xiàn)p14ARF、mdm2、p53表達(dá)有相關(guān)性。腫瘤形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，而非單純的線性關(guān)系，有必要進(jìn)一步的研究。
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